直接PCR（Direct PCR）是一種不經(jīng)核酸提取而直接使用動物或植物組織等直接進行擴增的反應(yīng)。在許多方面,，直接PCR的工作方式類似于常規(guī)PCR,。
主要區(qū)別是直接PCR中使用的定制緩沖液，樣本可不經(jīng)過核酸抽提,，直接進行PCR反應(yīng),，但對于參與直接PCR反應(yīng)的酶的耐受性和buffer的兼容性有相對應(yīng)的要求。
盡管常見的樣品中或多或少都會存在PCR抑制劑,，但在酶和buffer的作用下直接PCR仍可實現(xiàn)可靠的擴增,。而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)需要以高質(zhì)量的核酸為模板進行反應(yīng)，如模板中含有蛋白以及其他雜質(zhì)時就會抑制PCR反應(yīng)的順利進行,。直接PCR是目前分子診斷領(lǐng)域比較熱門的技術(shù)之一,。
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直接PCR最初用于動植物
直接PCR最早應(yīng)用的領(lǐng)域是動植物領(lǐng)域，比如鼠,、貓,、雞、兔,、羊,、牛等動物的血液、組織和毛發(fā)；植物的葉片和種子等,，用來研究基因分型,、轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒檢測,、基因敲除分析,、DNA來源鑒定、物種鑒定,、SNP分析等領(lǐng)域,。
這些領(lǐng)域有一些共同的特點，那就是目標基因的含量比較高,，核酸提取麻煩,，所以直接PCR不僅能夠節(jié)省時間，對結(jié)果的影響很小,，同時也能節(jié)省成本,。
直接PCR用于病原體檢測，是近幾年的事,，部分PCR試劑廠商在做創(chuàng)新的時候朝著這個方向做了很多的努力,，尤其是這次新冠疫情，市場上出現(xiàn)了很多這樣的檢測產(chǎn)品,！
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直接PCR需要的試劑
樣本裂解液
樣本裂解液可以自己配置,，也可以購置。不同品牌裂解液組份的差異會使得裂解能力各有不同,，進而裂解時間稍有差異,。比如說動物組織樣本制備，一般推薦30min或過夜裂解,，針對病毒類的裂解液在3-10min不等,。
PCR master mix
建議使用熱啟動DNA聚合酶，增強特異性擴增,，擴增能力也更強,。直接PCR的核心就是具有高度耐受的聚合酶。
清除或抑制樣本中影響DNA擴增的組份
樣本在經(jīng)過裂解液處理之后,，會釋放出蛋白質(zhì),、脂質(zhì)和其他細胞碎片，這些物質(zhì)會抑制PCR反應(yīng),，因此直接PCR需要加入相應(yīng)的清除或者抑制劑來減弱這部分因素的影響,。
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直接PCR五大知識點薈萃
第一、Direct PCR技術(shù)是針對各類生物樣品的直接PCR技術(shù),。該技術(shù)條件下,，無需對核酸進行分離提取,，直接以組織樣本為對象，加入目標基因引物進行PCR反應(yīng),。
第二,、Direct PCR技術(shù)不僅僅是傳統(tǒng)的DNA模版的擴增技術(shù)，也包含RNA模版的逆轉(zhuǎn)錄PCR,。
第三,、Direct PCR技術(shù)不僅僅是直接對組織樣本進行常規(guī)定性PCR反應(yīng)，還包括Real-Time qPCR反應(yīng),，這就要求反應(yīng)體系具備極強的抗背景熒光干擾能力以及對內(nèi)源性熒光淬滅劑的拮抗能力,。
第四、Direct PCR技術(shù)針對的樣本,，只需要核酸模版的釋放,，并不對干擾PCR反應(yīng)的蛋白、多糖,、鹽離子等進行去除,，這要求反應(yīng)體系中的核酸聚合酶和PCR Mix具有極佳的抗逆性和適應(yīng)性，能夠在復(fù)雜的條件下保證酶活性和復(fù)制準確性,。
第五,、Direct PCR技術(shù)針對的組織樣品未經(jīng)任何核酸富集處理，模版量極少,，這就要求反應(yīng)體系有極高的靈敏度和擴增效率,。
參考資料：翊圣生物、賽默飛生命科學(xué)等
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